Donkey Kong 64 comienza con una vista al lugar donde sucede la mayor parte del juego: la Isla Donkey Kong (no es igual a la de la saga de Donkey Kong Country). Luego, se muestran los planes de King K. Rool de destruir dicha isla. Para distraer a DK, ordena secuestrar a sus amigos y robar los Plátanos Dorados (201 en total). Luego, DK es avisado por Squawk el loro, y de inmediato se pone en acción.
DK debe ir completando varios niveles, sean en su isla, en la isla K. Rool o en escenarios encontrados en el cielo a los cuales se les llegaba mediante cañones e ir derrotando a los jefes para ganar las llaves DK, estas sirven para abrir la jaula de K. Lumsy.
Además, en cada nivel existen 25 Plátanos Dorados (5 por cada Kong), una Corona de Batalla, 2 Hadas Plátano, 500 Plátanos de colores (100 por cada Kong y un color de banana por cada Kong), y una llave DK, que se obtiene acabando con el jefe.
Para acceder al jefe, se debe entrar en el portal de Troff y Scoff, entregándoles los Plátanos que piden. Sólo se puede acceder con el personaje indicado en la gran puerta.
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